恶性肿瘤是异质性最明显的人类疾病，通过分子诊断指导患者个体化的精准治疗，已逐渐成为肿瘤临床治疗的共识。原发性前列腺癌(PC)是空间异质性最强、克隆性最复杂的癌症之一,不同患者之间，甚至同一肿瘤的不同部位之间，以及同一患者不同治疗阶段，存在各不相同的生物学特征，肿瘤在时间和空间上的异质性及组织标本不易获取的现实，限制了常规临床实践中基于组织的分子图谱的实施。而以血液为基础的液体活检的作用和价值越来越凸显。本文章对PubMed/MEDLINE数据库自年至年7月发表的PC中循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和细胞外小泡(EV)的相关文献进行系统综述，它阐明了随着肿瘤进展而进化的基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组等多种特征。液体活检对局限型PC的诊断特征、风险分层和疾病监测以及晚期疾病的敏感/耐药生物标志物和预后标志物具有重要价值。晚期转移性PC中的CTC和ctDNA含量明显升高，大多数临床应用的开发都基于此。相较于传统的组织活检，液体活检的主要优势是创伤较小，患者容易接受，非常方便进行实时动态监测。而且在液体状态下，各种肿瘤来源的成分相对均一，更容易从整体角度反映肿瘤在时间及空间上的异质性。但不管是传统组织活检，还是液体活检，尽管它们各具优缺点，但从本质上来说，都是获取肿瘤遗传物质进行分子诊断，彼此之间不应排斥或对立，而应互为补充，从各个不同的时间、空间和角度来反映肿瘤的特性。相信未来随着液体活检相关技术的不断完善和发展，液体活检将会在PC个体化精准医疗中发挥越来越重要的作用。
EU最新发表综述：液体活检助力文章标题：QuantitativeandQualitativeAnalysisofBlood-basedLiquidBiopsiestoInformClinicalDecision-makinginProstateCancer期刊：EuropeanUrology影响因子：17.发布时间：年12月Take-homemassage
液体活检为前列腺癌的诊断及治疗提供了一种微创的选择。血液中的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和细胞外小泡(EV)包含了多种与前列腺癌相关的生物标志物，这些生物标志物对局限性前列腺癌以及精准使用靶向药物(如雄性激素靶向药物)具有临床意义，同时也能够推动前列腺癌的药物开发。前列腺癌(PC)的诊断面临着一系列挑战，如肿瘤基因组的时空异质性以及难以进行转移性组织活检，这些因素限制了常规临床实践中基于组织的分子图谱的实施，而以血液为基础的液体活检为PC的诊断提供了一种有吸引力的、微创的选择。该研究对PubMed/MEDLINE数据库自年至年7月发表的PC中循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和细胞外小泡(EV)的相关文献进行系统综述，探讨其潜在的应用价值以促进精准医学的发展。
液体活检主要包括检测CTC、ctDNA或EV中的DNA、RNA和蛋白质，它阐明了随着肿瘤进展而进化的基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组等多种特征。液体活检对局限型PC的诊断特征、风险分层和疾病监测以及晚期疾病的敏感/耐药生物标志物和预后标志物具有重要价值。晚期转移性PC中的CTC和ctDNA含量明显升高，大多数临床应用的开发都基于此。因此，在临床实施之前，检测和分析/临床验证的标准化十分必要的。
精读板块
在西方国家中，前列腺癌(PC)在所有癌种中发病率排名前四，年全球预计有1,,例新确诊病例，死亡人数达到,例。原发性PC是空间异质性最强、克隆性最复杂的癌症之一，活检作为标准操作但收益有限，而且目前的活检固定程序会影响DNA质量；同时，成骨细胞转移性病变的活组织检查在技术上也具有一定的挑战性。
图1.年全球前列腺癌发病率(CulpMaryBethetal.,)液体活组织检查指的是对存在于体液中的肿瘤物质进行分析，被测物质主要包含：循环肿瘤细胞（CTC）
循环肿瘤DNA（ctDNA）
细胞外小泡（EV）
RNA、蛋白质和线粒体DNA等液体活检已经成为以微创方式研究肿瘤分子特征的一种有效方法，基于液体活检的生物标记物也可以作为临床试验的早期终点，以加快药物开发。对此，本文对基于血液的液体活检组分的当前信息，它们对PC临床决策的影响，加速精确医学的机会，以及在临床实践中实施此类检测的挑战等进行了回顾。
图2.ctDNA的产生和清除(Maia,ManuelCaitanoetal.,)CTC、ctDNA和EV的检测有助于临床决策
(1)循环肿瘤细胞(CTC)CTC是来自原发灶或转移灶的被动脱落或主动从肿瘤迁移到循环系统的癌细胞，它在循环中的半衰期较短(1-2.5小时)，且血液中CTC的数量相对较少，对全面的分子研究产生了障碍。CTC是从7.5-10ml的外周血液样本中分离出来的，它的负荷随着疾病进展而增加；而对于大多数局限型肿瘤而言，CTC负荷非常低或接近于零。然而，肿瘤病灶和病变是否都反映在CTC数量中仍存有争议。目前，从血液样本中分离CTC有许多不同的方法。分离方法通常是基于免疫亲和力的，即依赖于选择表达特定抗原的细胞(阳性选择)，而忽略表达其他抗原的细胞(阴性选择)。例如，使用针对上皮细胞表面标志物(如EPCAM(CD))的抗体进行阳性选择，而忽略基于白细胞标志物(如CD45、CD16或CD66b)的正常血细胞。然而，几项研究显示上皮细胞标记物在CTC中的表达不同，表明仅基于EpCAM的表达进行选择可能会遗漏部分CTC。因此，其他使用非依赖于EpCAM的平台应运而生，例如通过鉴定所有有核细胞内特定的肿瘤相关蛋白的表达(即CK8和AR)和细胞形态识别CTC。利用CTC独特的物理特性也可以从血液中分离CTC，如与非肿瘤循环细胞相比，CTC具有不同的变形性、密度、表面电荷和大小。目前已经开发了几种使用这种方法的微流控装置。
表1.PC中分离CTC的不同策略CTC中的DNA和RNA可以作为肿瘤基因组分析的指标。对单个CTC进行研究可以对肿瘤内的异质性进行精细的剖析，从而有助于理解治疗耐药性。然而单细胞定性还远远不能应用于临床。克隆的全基因组拷贝数可以识别与转移等侵袭性表型相关的基因组不稳定特征。目前，全外显子组测序(WES)鉴定突变的方法已被证明是可行的。由于CTC与雄激素受体(AR)靶向制剂有潜在的临床相关性，对CTC中异常AR转录体的研究已成为热点。除了AR，多重分析还可以对CTC的肿瘤转录物进行全面分析，方法包括多重定量PCR，单细胞RNA序列分析等。CTC核质AR-V7的检测与AR信号抑制剂(ARSi)的反应相关，前列腺特异性膜抗原(PSMA)在CTC中的表达也可能与放射性药物的开发有关，这表明CTC的蛋白表达可以作为预测性生物标志物。
(2)循环肿瘤DNA(ctDNA)循环DNA(cfDNA)指的是正常细胞和/或肿瘤细胞凋亡或坏死后进入循环系统的短双链DNA片段(bp)。在癌症患者中，可以在比核小体DNA短的DNA片段中观察到肿瘤突变的等位基因。源自肿瘤的cfDNA被称为ctDNA。ctDNA被非肿瘤cfDNA稀释是一个重要的混杂因素，因此cfDNA产量和质量的最大化需要一些分析前的准备。分离和量化cfDNA后，可以通过对携带肿瘤特异性畸变(例如，点突变、拷贝数改变和基因组重排)的读取频率的计算分析来判断其是否属于ctDNA；也可以通过cfDNA的大小来判断ctDNA，因为ctDNA片段往往比非肿瘤cfDNA片段更小。此外，cfDNA的这种特殊的片段化模式也被认为是癌症类型特异性的，因此可能被用于诊断。
图3.血液中cfDNA研究的分析前、分析和分析后步骤ctDNA的数量通常在疾病晚期伴随肿瘤负荷增高而增加。例如，在两项关于转移性去势抵抗前列腺癌(mCRPC)的研究中，ctDNA占比可达15-20%。靶向测序方法是一种更实惠的策略，可以在基因组的特定区域提供高阅读深度，但前提是在靶区内至少存在一个体细胞突变，以推断ctDNA比例，而检测到突变的概率随着靶区的大小而增加。高灵敏度分析，如微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)，可以检测到灵敏度在0.%到1%之间的AR点突变和拷贝数增加。然而，它的应用仅限于对单个或一小部分已知突变(多重ddPCR)的分析，这有利于监测肿瘤对靶向治疗的适应性，特别是热点突变或先前通过更大规模测序确定的突变。靶向测序的结果显示，ctDNA与转移组织活检中在选定的PC驱动基因的改变拥有良好一致性。也有相关研究在ctDNA上使用WES，结果显示，尽管WES要求肿瘤比例10%，此方法也与组织活检高度一致。例如亚克隆突变的低频率事件更有可能在肿瘤比例较低的样本中被掩盖。事实上，推断突
变的克隆起源与亚克隆起源需要捕获足够的ctDNA等位基因，以确定克隆阈值。通过将测序深度分配到较少的基因组区域，靶向测序可以用于研究低等位基因频率的事件。相比于ctDNA检测，cfDNA甲基化分析可能比体细胞改变分析更敏感，因为有数百万甲基化标记可用于分析，而体细胞变化只有几千种。最近对肿瘤和cfDNA样本的研究已经确定了基于甲基化的PC亚型和疾病进展过程中的变化。
(3)细胞外囊泡(EV)EV是具有脂质双层的分泌性囊泡，大小一般在50nm~1μm之间。EV通常来自质膜(如微囊泡)，或内体起源(如外体)。最近的一些研究也表明较小的(外体，35nm)和较大的(胞体，1-10μm)EV在癌症中起到了重要作用。国际EV协会（ISEV）建议将EV按以下条件分类：①尺寸(小型[nm]、中型[-nm]或大型[nm])；
②生化成分(如CD63+/CD81+)；
③来源细胞。EV中包含蛋白质、脂质、代谢物、mRNA、miRNA和DNA，它在癌症进展和转移过程中的细胞间通讯以及在触发免疫反应方面起着关键作用。此外，EV与癌症患者的转移或复发有关，可以作为诊断和预后的标志，因此也可以用于检测治疗靶点。到目前为止，探究血液EV与PC的相关性的研究较少，大多数EV研究的样本都提取自尿液。EV的大小对其分离和量化的准确性和可靠性是一项重大挑战。超速离心目前被认为是EV分离的金标准方法，但为了增加特异性，还可以采用如超滤、密度梯度和层析等其他技术。对EV及其内含物的分子鉴定/检测方法包括了用于分析前列腺特异抗原(PSA)、PCA3、ERG、AR或AR-V7以及大型EV的WGS的转录分析(ddPCR、实时PCR和RNA-SEQ)。
定量预后和反应生物标志物可以促进药物开发
对于转移性前列腺癌（mPC）的治疗，药物批准通常是基于总生存期(OS)或放射学无进展生存期(rPFS)的改善。CTC和cfDNA/ctDNA动力学可作为mPC的预后和反应生物标志物，为临床试验提供参考，并加速药物开发。CTC计数在乳腺癌中的预后价值已被得到证实：一项研究使用CellSearch系统，在最佳阈值为7.5mL血液中检测出了≥5个CTC。在开始化疗前对PC患者进行的两项研究表明：(1)每7.5mL血液中CTC数达到或超过5个，OS较短；(2)治疗开始后CTC计数下降(每7.5mLCTC数低于5个；CTC转换率)与OS相关，是比PSA变化更强的预测因子。一项对5个独立随机临床试验的Meta分析也证明了CTC动力学可以优于PSA变化作为反应生物标志物。自此，CTC计数作为反应的生物标记物被纳入了几个II期试验，包括PC中奥拉帕利的概念验证研究，其中CTC动力学与rPFS密切相关。进一步的研究还表明，CTC计数的相对变化(从基线下降30%)是潜在的替代终点。此外，CTC动力学可以作为疾病进展的指标来辅助治疗切换决策；治疗10-12周后CTC计数的增加与rPFS和OS的降低显著相关。有趣的是，表达与CTC相同的细胞表面捕捉标记(EpCAM)的肿瘤来源的大型EV可以与它们共分离，并在CellSearch等平台上进行研究。这些EpCAM+EV的计数可能对mCRPC有预后价值，以进一步对CTC计数良好的患者进行分层。目前还需要更多的研究来证实不同液体活检方法的组合如何改善患者分层。cfDNA(尤其是ctDNA)产量随着癌症进展而增加，与总体肿瘤负荷标记物(PSA、LDH和碱性磷酸酶)相关。在对FIRSTANA和PROSELICA基于紫杉烷的治疗的III期试验的名患者的分析中，cfDNA基线水平是rPFS和OS的独立预后因素。此外，治疗过程中cfDNA水平的绝对和相对变化与PSA反应相关。同样，在TOPARP-A试验中，奥拉帕利治疗后cfDNA水平下降50%与rPFS和OS密切相关。在醋酸阿比特龙与恩杂鲁胺的随机试验中，ctDNA可通过WES和深度定向72基因测序进行量化。较高的ctDNA比例(30%)与包括PSA、LDH和碱性磷酸酶的肿瘤负荷临床标记物相关，因此可以作为预后因素。ctDNA30%的患者rPFS最差，其次是2%至30%，未检测到ctDNA的患者进展时间更长。在激素缺乏的mPC环境中，雄激素剥夺治疗最初几周的ctDNA水平迅速下降。
液体活检可应用于局限性前列腺癌的检测
目前评估明确局部治疗后复发风险的主要依据包括：治疗前血清PSA含量、国际泌尿系统病理学会活检分级和临床T分类。不同的生物标记物(如PTEN状态、TP53突变和筛状组织学)和基于组织的分子标记(如Decipher和OncotypeDX)已被提出用来改善局限性PC的患者分层，且已被纳入临床指南，但它们对治疗决策的影响仍然有限。一些研究已经证明在局限性PC患者体内存在扩散性癌细胞，特别是在骨髓中，这为通过液体活检研究传播疾病提供了理论基础。一项研究利用CellSearch平台在局限性PC患者(n=97)中检测到了CTC的存在，活检阳性患者和阴性对照患者中检测到CTC的比例相似(21%比20%)，且CTC的计数很低(每个样本只有1~3个CTC)。最近的一项研究使用了EpicSciences平台在33/45(73%)的高危局限性PC患者中确定了CTC。一项结合了三种独立CTC检测(CellSearch、CellColector和EPISPOT)的研究发现非转移性高危PC患者的累积阳性率为81%，但只有21%的患者含有≥5个CTC/7.5mL血液。此研究表明，复合生物标记物分析可能有助于局限性PC中的液体活检。总之，局限性PC患者血液中CTC的数量很少，这使得潜在的临床应用具有挑战性。尽管在甲基化、等位基因失衡和LOH的研究中已经证实了局限性PC患者中ctDNA的存在，它在早期疾病环境中的表达仍旧极低，这对临床测试的下游适用性提出了挑战。对于PC患者的ctDNA检测的研究表明，即使在前列腺切除术前血清PSA水平较高且随后复发的患者中，lpWGS或靶向测序也没有检测到显著的ctDNA。而血液中的肿瘤EV作为PC生物标记物的研究仍然相对空缺。一项研究使用PSMA表达来富集来自良性前列腺增生或局限性PC肿瘤患者的EV，结果显示，随着低危PC向高危PC进展，PSMA阳性的EV浓度呈上升趋势。
液体活检有助于AR靶向药物的精准使用
由于AR活性的改变，AR靶向药物经常发生耐药。而液体活检可以随着时间推移重复进行，这为更精确的ARSi应用提供了一个生物标记物分层的机会。研究表明，在ctDNA中可以检测到AR扩增和突变，并与较差的OS、PFS和PSA应答率相关，血浆样本也可以用来监测肿瘤动力学和新出现的耐药机制。在CTC中检测AR具有临床价值，研究表明在接受恩杂鲁胺和阿比特龙治疗的mCRPC患者中，高达39%和19%的患者存在AR-V7阳性的CTC，这与较低的PSA应答和较短的生化无进展生存期(bPFS)有关。这一点在一项更大的前瞻性研究中得到了进一步验证，其中mCRPC患者被归类为CTC-、CTC+/AR-V7-和CTC+/AR-V7+。CTC+的PSA应答率、bPFS和OS较短，而AR-V7+CTC患者的PSA反应率、bPFS和OS更短。在使用两种分离方法(AdnaTest和EpicSciences分析)的预测性多中心前瞻性试验中，在CTC中AR-V7的存在被进一步证实为不良结果的独立预测因子，因此AR-V7状态可能同时提供预后和预测性信息。
液体活检为靶向治疗提供预测性生物标志物
由于ctDNA可能包含不同转移灶脱落的物质，使用它作为预测性生物标记物的液体活检比组织活检更有优势。在ARSi治疗mCRPC的随机II期试验中，检测到TP53突变、DDR基因改变或ctDNA中AR扩增与较差的临床结果相关。其他研究也已证实ctDNATP53改变的患者预后较差。关于mPC的几个临床试验现在正在使用cfDNA二代测序(NGS)测试靶向药物。奥拉帕利的TOPARP-A试验在ctDNA中检测到了BRCA2和PALB2在二次耐药时的回复突变，表明血浆和肿瘤之间的DNA错配修复(DDR)突变状态有良好的相关性。也有研究发现了PC患者的ctDNA中的AKT1和PIK3CA突变。此外，ctDNA中微卫星不稳定性和肿瘤体细胞超突变的检测与MMR基因缺陷有关，并可能与患者选择免疫检查点抑制剂有关。总体而言，尽管ctDNA中可以检测到肿瘤突变的生物标志物，但其在临床环境中的使用仍然存在挑战。例如，一项对两种不同的商业panel进行比较的研究显示，结果并不一致，这可能是由于panel的覆盖范围不同，但也可能是因为对某些改变的敏感度和特异性不同。这些结果强调了在前瞻性试验中追求ctDNA检测临床资格的必要性。PC-Bets(NCT)和ProBio(NCT)等伞形研究目前正在测试ctDNA在多臂临床试验中的临床价值。
结语
在过去的十年中，PC的液体活检领域取得了巨大进展，开发了预后和预测的生物标记物，并为监测肿瘤进化的遗传学提供了微创的手段。液体活检可以指导治疗决策，促进PC精准医学的发展。然而，需要解决与检测灵敏度和特异性的标准化、不同检测的预期临床合格性以及成本和可及性有关的问题，以支持它们在常规临床实践中的实施。
参考文献：
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